Ny kunnskap om biomarkører og fatigue ved Crohns sykdom

Fatigue er en vanlig og belastende tilstand hos pasienter med kroniske inflammatoriske sykdommer, som Crohns sykdom. De biologiske mekanismene bak fatigue er fortsatt ikke fullt ut kartlagt. En sentral hypotese er at aktivering av det medfødte immunsystemet og proinflammatoriske signalveier utløser fatigue som en del av sykdomsadferd (eng.: sickness behavior), en evolusjonært bevart, ikke-viljestyrt forsvarsmekanisme.

Hvorfor ble studien gjennomført?

HMGB1 er et nøkkelprotein i det medfødte immunsystemet, og frigjøres fra celler ved skade eller immunaktivering. Proteinet fungerer som et alarmsignal som stimulerer til produksjon av proinflammatoriske cytokiner, blant annet interleukin (IL)-1β, som er sterkt knyttet til utvikling av fatigue. HMGB1 aktiverer flere av de samme signalveiene som IL-1β, og kan derfor være en medvirkende faktor. Pasienter med kronisk inflammasjon har ofte forhøyede nivåer av HMGB1 i plasma, men sammenhengen mellom HMGB1 og fatigue hos mennesker er hittil lite undersøkt.

Autoantistoffer mot HMGB1 forekommer både hos friske og syke. De kan ha en regulerende effekt ved å dempe HMGB1s immunstimulerende egenskaper. Derfor ble både anti-HMGB1-antistoffer og andre biomarkører relatert til inflammasjon og cellulær stress inkludert i studien.

Forekomsten av anti-HMGB1-antistoffer gir betydelige begrensninger for bruk av ELISA ved analyse av HMGB1. En ELISA kan heller ikke skille mellom de ulike isoformene av HMGB1, som kan ha forskjellige biologiske funksjoner. En stor del av avhandlingen var derfor viet arbeidet med å etablere en metode som kan skille mellom isoformene og gi pålitelige målinger av HMGB1 i plasma. LC-MS/MS fremsto som et lovende alternativ, men krevde fjerning av «High abundance proteins» (HAPs) fra plasma. Det gjorde det nødvendig å evaluere og optimalisere den preanalytiske metoden før videre kvantitering av HMGB1 og dets isoformer med LC-MS/MS.

Hvilke metoder ble brukt og hvorfor?

Plasmaprøver, spørreskjema for måling av fatigue (fVAS, FSS, SF-36 vitalitet) og kliniske data ble innhentet fra pasienter med nyoppdaget Crohns sykdom og friske kontrollpersoner som deltok i en studie om IBD (inflammatorisk tarmsykdom) ved Stavanger universitetssjukehus (SUSI-studien).

Anti-HMGB1-antistoffer (artikkel I) og øvrige biomarkører (artikkel II) ble målt i plasma ved hjelp av egenutviklede og kommersielt tilgjengelige immunoassays. Statistiske analyser inkluderte regresjonsanalyser og prinsipal komponentanalyse.

Ulike metoder for prøveopparbeiding ble testet på plasma tilsatt rekombinant HMGB1 (artikkel III) og evaluert basert på recovery og mengde HAPs som ble fjernet. Disse inkluderte:

• Immunpresipitering med Dynabeads og anti-HMGB1-antistoffer
• Presipitering av HAPs med perklorsyre
• Fraksjonering av plasmaproteiner med omvendt fase væskekromatografi (HPLC)

Den siste metoden var den mest lovende, da HMGB1 elueres fra en C18-kolonne tidligere enn de fleste andre plasmaproteiner. Dette gjorde det mulig å samle en relativt ren fraksjon HMGB1-protein for videre analyse med LC-MS/MS.

Analyse av de opprensede prøvene på høyoppløselig LC-MS/MS identifiserte peptider fra HMGB1, som muliggjorde nøyaktig kvantitering og differensiering mellom isoformer.

Hvilken betydning kan dette ha for pasienter, bioingeniørfaget eller fagfeltet?

Studien viste at pasienter med høyere nivåer av anti-HMGB1-antistoffer opplever mindre fatigue, målt med fVAS-score. Dette kan tyde på at HMGB1 er involvert i utviklingen av fatigue, og at antistoffene har en beskyttende eller regulerende effekt på HMGB1, som pådriver av fatigue.

Plasmakonsentrasjoner av andre biomarkører indikerer at fatigue hos pasienter med Crohns sykdom involverer et nettverk av proinflammatoriske (HMGB1, IL-1β) og stressrespons-relaterte biomolekyler (HSP90α, HPX).

Resultatene gir håp om mer pålitelige analyser av HMGB1 i blod og økt forståelse av proteinets rolle i sykdomsutvikling. Dette kan også bidra til bedre kunnskap om fatigue ved Crohns sykdom og andre kroniske betennelsestilstander.