Resultatene ble imidlertid lite påaktet inntil 1931, da Kuhn og medarbeidere tok opp tråden og utviklet adsorbsjonskromatografien videre. I årene som fulgte, ble denne teknikk benyttet av stadig fler og fler, og i denne forbindelse bør svensken Tiselius nevnes for hans innsats både på teoretiske og eksperimentelle plan.
I 1941 ble fordelingskromatografi for første gang tatt i bruk, og i 1944 beskrev engelskmannen Martin og hans medarbeidere papirkromatografi. Ved hjelp av denne teknikk var man nå i stand til å utføre en to-dimensjonal separasjon. Hva papirkromatografi har betydd og fremdeles betyr for biokjemien, skulle være unødvendig å omtale nærmere; en kan for eksempel bare minne om kartleggelsen av insulinets aminosyre-sekvens, eller om oppklaringen av mekanismene bak fotosyntesen. I årene omkring 1945-1950 begynte man for alvor å ta i bruk ionebytter-kromatografi, for eksempel til å skille de forskjellige aminosyrer.
Det neste, store fremskritt skjedde i 1952 da James og Martin for første gang beskrev en gasskromatografisk separasjon. Gasskromatografi har i de etterfølgende år utviklet seg til å bli et av de beste analytiske hjelpemidler man overhodet er i besittelse av. Det nyeste, betydningsfulle trinn i utviklingen av kromatografiske metoder, skjedde i 1958-1960 da tynnskikt kromatografi og gelfiltrering ble introdusert. Begge hjelpemidler er blitt en suksess. Tynnskikt kromatografi for eksempel, er på vel til å konkurrere ut papirkromatografi, mens gelfiltrering nesten fullstendig har overtatt den rollen dialyse spilte før.
Alle fysiokjemikere har stiftet bekjentskap med en eller flere av de mange forskjellige kromatografiske metoder. De praktiske aspekter innen dette feltet skal derfor ikke betrakte kromatografien fra et mer generelt omtales, men istedet skal vi i det følgende og prinsipielt synspunkt. Et spørsmål som naturlig melder seg er: Hva menes egentlig med kromatografi? I følge Martin kan et slikt spørsmål best besvares på følgende måte: «Chromatography is the uniform percolation of a fluid through a column of more or less finely divided substance, which selectively retards, by whatever means, certain components of the fluid.»
Denne definisjonen er meget vid, og omfatter blandinger av gasser såvel som væsker, og unngår med hensikt å beskrive de mekanismer som er ansvarlig for den selektive retardasjonen.
Ordet «column» er ment å inkludere alle eksperimentelle arrangementer fra de vanlige sylindriske glasskolonner til tynne papirark eller tynne skikt av et porøst materiale fordelt utover en glassplate. Det fint-fordelte, porøse materialet som en slik «kolonne» er fylt med, kan ha to roller. For det første kan det aktivt inngå i selve separasjonsprosessen, slik som i adsorbsjonskromatografi. For det andre kan det ha som oppgave å virke som et bæremateriale for en annen aktiv fase (vanligvis væske) slik som i fordelingskromatografi.
Det er altså to grunnleggende trekk felles for alle kromatografiske separasjoner: (1) Kromatografi er prosesser hvor en mobil fase, det være seg væske eller gass, skyller gjennom en annen fase (fast eller flytende) som er stasjonær (2). Separasjonen av de enkelte komponenter kommer i stand fordi forskjellige stoffer vandrer forskjellig gjennom et slikt tofasesystem.
En kromatografisk separasjon, definert som ovenfor, kan som først påpekt av Tiselius utføres på prinsipielt 3 forskjellige metoder; nemlig ved hjelp av såkalt frontalanalyse, fortrengningsanalyse (displacement analysis) eller elueringsanalyse (elution analysis, Zonal analysis, Liquid chromatogram). Av disse tre metoder er det overveiende den sistnevnte, dueringsanalysen, man bruker i praksis. De to førstnevnte metoder har betydelig teoretisk interesse, men benyttes forholdsvis sjelden i praksis, og vil av den grunn ikke bli omtalt her. Derimot skal det sies litt mer om elueringsanalysen. Dens store fordel er at alle komponentene i blandingen kan (ideelt) separeres og isoleres i ren tilstand. Blandingen som skal kromatograferes plasseres som en smal sone på toppen av kolonnen. Denne sonen får man til å bevege seg gjennom kolonnen ved hjelp av et dertil egnet elueringsmiddel. Noen komponenter flytter seg raskt, andre går langsommere gjennom kolonnen, avhengig av stoffenes distribusjon mellom den stasjonære og mobile fase. Ved enden av kolonnen kommer de enkelte komponenter ut en etter en.
Ved elueringsanalyse får man, i motsetning til frontal og fortrengningsanalyse, innen visse grenser bedre separasjon jo lengre kolonnen er. Dog kan ubegrenset lange kolonner ikke benyttes, fordi diffusjon, temperaturvariasjoner, samt den kontinuerlige utveksling av den enkelte komponent mellom stasjonær og mobilfasen, forårsaker at bredden til toppene på kromatogrammet øker, samtidig som høydene på toppene (konsentrasjonene) avtar med kolonnelengden. Dessuten blir motstanden i søylen større jo lengre kolonnen er, slik at tilslutt vil hverken gass eller væske kunne passere gjennom den.
Den teoretiske behandling av elueringsanalysen er et kapitel for seg. Det er særlig to metoder som er i bruk for å forklare den kompliserte mekanismen bak en kromatografisk separasjon. Den første er Wilsons kontinuerlig-utskiftnings teori, som er en ren matematisk (differensialregning) formulering av problemet. Den andre er Martin og Synge's «plateteori», som er lettere å forstå og som er den mest kjente og utbredte metode. Denne teori kan anvendes på alle typer kromatografi, enten det er adsorbsjon, fordeling eller ionebytting det dreier seg om.
Den krever med andre ord ikke kjennskap til de molekylære mekanismene bak selve separasjonen. Derimot forutsettes en såkalt lineær distribusjonsisoterm, dvs. forholdet mellom mengden av en komponent i den stasjonære fasen, og mengden av den samme komponenten i den mobile fasen, skal være uavhengig av komponentens konsentrasjon. I praksis har man ofte med bare tilnærmet lineære distribusjonsisotermer å gjøre, men avvikene er som oftest av mindre betydning.
I «plateteorien» tenker man seg kromatografikolonnen oppdelt i en rekke seksjoner eller «plater», med diameter lik kolonnens diameter, og med høyde som er så stor at den mobile fasen som forlater platen, er i likevekt med platens stasjonærfase. Denne høyden kalles HETP (Height of an Equivalent Theoretical Plate). Jo mindre HETP er, dvs. jo flere «plater» vi får plass til i en kolonne, desto mer effektiv er dens separasjonsevne. I en god ionebytter- eller fordelingskromatografi kolonne er HETP fra 0,2 til 1 mm. I gasskromatografi, spesielt på kapillar kolonner, kan HETP være enda mindre, og man kan her komme opp i et totalt platetall som nærmer seg en million, noe som igjen forklarer den enorme separasjonsevnen en gass-kromatografisk kapillarkolonne har.
Distribusjonsbrøken D, definert som: D = mengde stoff oppløst i stasjonærfase/mengde stoff oppløst i mobiIfase, er av overordentlig stor betydning for separasjonen. Har to forskjellige stoffer identisk D i et system, kan de ikke separeres ved hjelp av dette systemet. Vi skjønner også at jo større D er for fordelingen av et stoff mellom den stasjonære og mobile fase, desto lenger tid tar det før stoffet kommer ut av kolonnen. Platetallet og dermed effektiviteten til en kolonne kan bestemmes på følgende måte: Et stoff kromatograferes på vanlig måte i kolonnen, og fraksjoner samles og analyseres, og kromatogrammet tegnes opp. Avstanden fra start til toppens maksimum måles (V). Bredden på toppen ved basislinjen kalles X. Antall teoretiske plater (P) er da: P = 16(V/X)2, og hvis lengden er L, er HETP = L/P. Disse uttrykk brukes særlig meget i forbindelse med gasskromatografi, men gjelder også for andre typer kromatografi.
Som nevnt ovenfor kan både adsorbsjonskromatografi, fordelingskromatografi og ionebytterkromatografi etc. sammenfattes under betegnelsen kromatografi. Forskjellen på metodene ligger i mekanismene bak den selektive retardasjonen av de ulike komponenter i en blanding. I adsorbsjonskromatografi er den stasjonære fasen alltid et fast stoff, dvs. en aktiv adsorbent med en stor overflate, f.eks. aktivert kull eller alumininumoksyd. Den mobile fasen er som regel væske, men kan være en gass. De retarderende krefter, dvs. tendensen til et stoff å oppholde seg i den stasjonære fasen, skyldes overflateaktivitet, van der Waal's krefter og steriske forhold.
I fordelingskromatografi er den stasjonære fasen alltid en væske, som er fordelt utover en bærefase, f. eks. papir eller kieselguhr, som skal være så inaktiv som mulig. Den mobile fasen er enten væske, som i papirkromatografi, eller gass, som i gasskromatografi. Separasjonen av en blanding beror på den relative løslighet eller fordeling av de forskjellige komponenter mellom stasjonærfasen og den mobile fase. Siden vi har med løslighet å gjøre, vil de retarderende krefter bl.a. omfatte hydrogenbindinger, dipol-interaksjoner og dissosiasjon og assosiasjonseffekter.
Både i adsorbsjon og fordelingskromatografi spiller polariteten på de forskjellige komponenter en meget stor rolle. Det er således lett å skille fra hverandre et polart og et upolart stoff, mens det er atskillig vanskeligere å separere to stoffer med omtrent samme polaritet. Hvis man ønsker å separere en blanding f.eks. ved hjelp av adsorbsjonskromatografi, er det nyttig å huske på at polare stoffer skilles best på polare adsorbenter (Al2O3), mens upolare stoffer skilles best på upolare adsorbenter (aktivt kull). Polariteten på elueringsmidlet spiller i slike tilfeller også en avgjørende rolle.
Med visse unntak, finner en at effektiviteten til elueringsmidlet øker med økende polaritet, dvs. jo større dielektrisitetskonstant et elueringsmiddel har, desto lettere vil det eluere et adsorbert stoff.
Ved ionebytter kromatografi er de retarderende krefter av en helt annen natur, nemlig elektrostatiske. De ioniske egenskaper ved et stoff er således av avgjørende betydning for separasjonen i disse tilfeller.
Tilslutt må det tilføyes at selv om man skiller mellom adsorbsjon, fordeling og ionebytter kromatografi, vil det i praksis alltid være en viss overlapping mellom disse former. Det er således ikke uvanlig at den aktuelle separasjon kommer istand ved en kombinasjon av alle tre typer kromatografi, men at en av dem er dominerende. Ved kromatografi på f.eks. en søyle av aktivt kull, vil adsorbsjon dominere, ved papirkromatografi vil fordeling dominere, mens en separasjon på Dowex-50 domineres av ionebytterkromatografi.
Les også tidligere artikler i denne serien :
Nukleærmedisin: Et fagfelt for bioingeniører også i framtiden?
Medisinsk bruk av radionuclider (fra 1966)
Transfusjonsmedisin - de lange linjene
Et blodtypesystem blir oppdaget (fra 1966)