Cystisk Fibrose (CF) er en arvelig tilstand som medfører sekresjon av unormalt viskøst slim i blant annet luftveier og fordøyelsessystemet. Konsekvensen er ernæringsproblemer og alvorlige luftveisinfeksjoner, som etter hvert forårsaker kroniske lungeskader. Årsaken til de fysiske symptomene ved CF er mutasjoner i et gen som koder for proteinet Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR). Proteinet er en ionekanal som transporterer kloridioner ut av epitelceller. Manglende syntese, prosessering eller endret funksjonalitet av CFTR-proteinet, forårsaker ubalansert ionetransport og gir de klassiske symptomene ved CF.
Det er beskrevet nærmere 2000 sekvensvarianter i CFTR-genet. Av disse er foreløpig bare 127 klassifisert som sykdomsfremkallende mutasjoner på både klinisk og funksjonelt grunnlag, det vil si at de både er funnet hos pasienter og at man har klart å påvise at mutasjonen svekker funksjonen til ionekanalen (1). Sykdommen er recessiv slik at bærere av én normal genkopi og én genkopi med en sykdomsfremkallende mutasjon, ikke vil få CF. Når to bærere får barn sammen er det 25 % sannsynlighet for at barnet blir sykt ved at det arver én sykdomsfremkallende genkopi fra hver av foreldrene.
Nyfødtscreening er regulert i Forskrift om genetisk masseundersøkelse av 1. januar 2012 (2) og medfører unntak fra Bioteknologilovens krav om skriftlig samtykke og genetisk veiledning. Nyfødtscreening er et frivillig, men svært viktig tilbud. Hensikten er å finne barn som blir født med en alvorlig sykdom hvor tidlig behandling kan gjøre stor forskjell på videre prognose, og i noen tilfeller hindre tidlig død. Fordelen med å oppdage nyfødte med CF er at de tidlig kan få forebyggende behandling mot underernæring og alvorlige, kroniske luftveisinfeksjoner. Det er vist i randomiserte studier at dette har betydning både for livskvalitet og levealder (3).
Immunoreaktivt trypsinogen (IRT) i blod er den sikreste biokjemiske markøren for CF og er betydelig forhøyet hos de aller fleste nyfødte med CF. IRT kan imidlertid også være forhøyet av andre årsaker (4), og er ikke tilstrekkelig spesifikk til å bli brukt alene til CF-screening. Prøver som gir et positivt resultat på IRT-testing blir derfor fulgt opp med genetiske analyser av CFTR-genet før rapportering av endelig screeningresultat. Påvisning av to sykdomsfremkallende CFTR-mutasjoner i screeningprøven gir sterk indikasjon på at barnet har CF og vil utvikle symptomer i løpet av livet og betraktes som CF-screening positiv.
Positivt svar kan imidlertid ikke alltid vise om de to mutasjonene sitter på forskjellige genkopier (dvs både på genet arvet fra mor og på genet arvet fra far) og heller ikke hvor stort utslag (penetrans) de enkelte mutasjonene vil få på sykdomsutviklingen.
Endelig CF-diagnose hos et barn med positivt resultat på nyfødtscreening, stilles ved påvisning av enten økt konsentrasjon av kloridioner i svette ved hjelp av pilocarpin iontoforese (indusering av svetteproduksjon over et lite hudområde for oppsamling), unormal ionetransport i neseepitel eller ved å påvise at de to sykdomsfremkallende CF-mutasjonene er lokalisert på hver sin genkopi (5).
Organisering av nyfødtscreening for CF i Norge
Nyfødtscreening i Norge er en nasjonal behandlingstjeneste lagt til Oslo Universitetssykehus, Rikshospitalet. Det skal tilbys nyfødtscreening til alle barn, og undersøkelsene forutsetter at foreldrene har fått informasjon om og samtykker til undersøkelsen. Blodprøven tas så raskt som mulig etter at barnet er blitt 48 timer, primært fra barnets hæl (figur 1). Prøven samles på et filterkort og tørkes før den sendes med A-post eller bud til Rikshospitalet i Oslo. Det fødes cirka 60 000 barn i Norge hvert år og nesten alle foreldre velger å teste barna for medfødte sykdommer.
Immunoassay for IRT
IRT-testing baseres på analyse av cirka 3 µl fullblod, tilsvarende en 3,2 mm sirkel stemplet ut fra prøvekortet. Analysene utføres med GSP Neonatal IRT kit og GSP-instrumentering fra Perkin Elmer (Turku, Finland). Prinsippet er basert på sandwich immunoassay av IRT med høysensitive, tidsstabile fluoroforer (Europium) som markør på sekundærantistoffet som brukes til kvantitering. Analyseprosessen foregår automatisert i GSP-instrumentet og konsentrasjonen av IRT er proporsjonal med fluorescensen fra frigitt Eu-markør. Ved positive funn blir prøven reanalysert i duplikat for å verifisere resultatet, og deretter fulgt opp med genetiske analyser.
Målsettingen er å oppdage flest mulig av barna som har CF. Av kostnadsmessige hensyn må antallet DNA-analyser begrenses og målet er å selektere 0,5 % av prøvene som har høyest IRT-verdi for oppfølgende genetisk analyse. Dette tilsvarer en cut-off på 60 ng/mL IRT.
Genetiske analyser av prøver med forhøyet IRT
Før innføring av CF-screening ble det foretatt en kartlegging av hvilke CFTR-mutasjoner som forekommer hos norske CF-pasienter, slik at disse kunne inkluderes i screeningens mutasjonspanel. Panelet ble i tillegg utvidet med mutasjoner som er funnet i andre land. De aller fleste av mutasjonene er beskrevet som sykdomsfremkallende i den internasjonalt anerkjente databasen CFTR2 (www.cftr2.org). En spesiell variant hvor aminosyren arginin er blitt byttet ut med en histidin på posisjon 117 i proteinet (p.R117H), representerer en spesiell utfordring ved nyfødtscreening. Mutasjonen gir relativt lav risiko for å utvikle sykdom samtidig som den forekommer hyppig i enkelte populasjoner. Denne varianten ble inkludert i DNA-panelet basert på kliniske vurderinger etter gjennomgang av pasientdata.
Metoden som best ivaretok utvidet DNA-testing var en allel-spesifikk mutasjonsanalyse av 71 CFTR-varianter (xTAG® Cystic Fibrosis 71 Kit v2) på Luminex (Luminex Corp., Oosterhout, Nederland) sammen med Sangersekvensering (6) av en lokalt vanlig mutasjon (“Bergensmutasjonen”). Sangersekvensering utføres med en 24 kapillærs sekvensator (3500 XL DX Genetic analyzer fra Applied Biosystems). Alle genetiske analyser baseres på ekstraksjon av DNA fra en 3,2 mm utstempling av blodprøve fra prøvekortet. Ved å teste alle prøver som er positive på IRT-analysen med dette oppsettet, vil 92,6 % av de kjente norske pasientmutasjonene være dekket samt flere andre internasjonalt kjente sykdomsfremkallende mutasjoner. Ved funn av bare én CFTR-mutasjon med dette oppsettet utføres utvidet testing med Sangersekvensering av ytterligere 20 sjeldne pasientmutasjoner. Etter den utvidede sekvenseringen vil alle mutasjoner som tidligere er observert i Norge være dekket. Resultatet ”CF-screening positiv” reserveres for de barna hvor det er påvist to sykdomsfremkallende CFTR-mutasjoner. Her vil foreldrene bli varslet for oppfølgende diagnostikk ved et CF-senter. Nyfødtscreeningen setter opp CFTR-testing én gang per uke, og et positivt resultat vil normalt foreligge innen to uker etter at prøven ankommer nyfødtscreeningen.
Prøver hvor det fortsatt bare er påvist én CFTR-mutasjon rapporteres som ”CF-screening negativ”. Bærere av sykdomsmutasjoner er ikke målgruppen for nyfødtscreening og en eventuell oppfølging av bærere er forbundet med en rekke etiske og praktiske utfordringer. CF-screening i Norge legger derfor til grunn at det bare er barn som har to påviste CFTR-mutasjoner blir varslet for diagnostisk oppfølging (figur 2).
Imidlertid, hvis prøven har fått påvist en spesielt høy IRT-verdi (>400 ng/mL), og det ikke er påvist CFTR-mutasjoner, varsles likevel foreldrene for oppfølging av barnet på grunnlag av tilsynelatende unormal biokjemi.
Oppfølging av barn som varsles fra Nyfødtscreeningen
Selv om to CFTR-mutasjoner er påvist eller IRT er unormalt høy, er det ikke avklart om barnet har CF eller hvor alvorlig tilstanden er. Svettetesten er ”gullstandard” for diagnose av klassisk CF og påviser i hvilken grad CFTR-ionekanalen fungerer. Barn med svekket ionekanal har kloridione-konsentrasjon på 60 mmol/L eller høyere. Normalverdien hos friske barn er under 30 mmol/L. Den sikreste metoden for svettetesting er å administrere den svettestimulerende substansen pilocarpin over et lite område hud ved hjelp av strøm (iontoforese) med direkte måling av klorid i den oppsamlede svetten. Det er bare CF-senteret ved Barneklinikken på Haukeland universitetssykehus (HUS) og CF-senteret ved Oslo universitetssykehus (OUS) som utfører diagnostikk og ivaretagelse av barn som har testet positivt for cystisk fibrose ved nyfødtscreeningen. Bakgrunnen for dette er krav til spesialkompetanse, kvalitet og volum av prøver. Foreldrene til barn som screener positivt for CF, blir derfor varslet av lege ved ett av disse to sentrene avhengig av regional tilhørighet. I tillegg til kvalitetssikret svettetesting og vurdering av eventuelle symptomer, måles fekal elastase for å kunne diagnostisere svikt i bukspyttkjertelen. Andre undersøkelser og klinisk oppfølgingsstrategi avgjøres som følge av klinisk vurdering.
Status etter to år med CF-screening
I løpet av de første to årene med CF-screening er det funnet 25 barn med positivt screeningresultat av de 121 102 prøvene som er blitt analysert. Disse er tilbudt diagnostisk oppfølging ved OUS og HUS. Det er i tillegg blitt funnet fem barn med IRT > 400 ng/mL uten mutasjoner, som også har fått tilbud om diagnostisk oppfølging.
Barn med mistenkt diagnose og negativ svetteklorid (< 30mmol/L) i to gjentatte målinger blir oppfattet som friske. De som har en svettetest i gråsonen (30-59 mmol/L) følges opp med ytterligere medisinske kontroller det første leveåret og deretter med årlige kontroller ved OUS eller HUS. Alle med usikre diagnoser vil få tilbud om oppfølging med supplerende undersøkelser av CF-spesialister ved OUS og HUS når de er fire-fem år.
En hyppig CFTR-variant, p.R117H, er spesielt utfordrende i screeningprogrammer. I kombinasjon med en annen sykdomsgivende CFTR-mutasjon kan utfallet være at barnet forblir friskt eller får mild CF-sykdom. Kombinasjonen kan også føre til mannlig infertilitet som eneste symptom. Flere screeningprogram i andre land har valgt å ikke rapportere funn av denne CFTR-varianten (7, 8). Det gjøres fortløpende evalueringer av mutasjonspanelet i screeningen også i Norge. Usikre funn representerer en betydelig belastning for foreldrene.
Det er kjent at barn som er født med forstoppelse forårsaket av den første avføringen (meconium ileus) kan få falske negative resultat i den primære biokjemiske screeningen på grunn av lave nivåer av IRT i blod (9). Det er også rapportert om nyfødte med CF som har IRT-verdier godt under vanlige cut-off grenser uten kjent årsak (10). Hvis et barn som har testet negativt på IRT oppviser kliniske symptomer som gir mistanke om CF, kan det være et falskt negativt screeningsvar på den biokjemiske analysen. Når et slikt tilfelle oppdages, vil resultatene fra den opprinnelige screeningprøven bli gjennomgått av nyfødtscreeningen for å følge med på screening-algoritmens validitet.
Basert på det omfattende mutasjonspanelet er det liten sannsynlighet for at DNA-testingen i seg selv vil gi falske negative prøvesvar, men det er en viss risiko for at tidligere ukjente mutasjoner unnslipper screeningen ved endringer i befolkningssammensetningen.
CF-screening er den desidert mest kostnadskrevende delen av nyfødtscreeningen i Norge. En lavere IRT cut-off er ønskelig for å unngå falske negative fra IRT-analysen, men det representerer en økonomisk utfordring med hensyn til oppfølgende DNA-testing basert på dagens løsninger. Med nye sekvenseringsteknologier, såkalt Next Generation Sequencing, er det mulig å senke prisen for mutasjonsanalyser samtidig som flere sykdomsfremkallende CFTR-varianter kan inkluderes i analysetilbudet. Basert på våre foreløpige analyser med denne teknologien har vi innført et enda bedre screeningtilbud for CF fra mars 2015 (figur 3).
